Inleiding

DNA-inbrenging in eukaryote cellen is een onmisbare techniek in de celbiologie en moleculaire biologie. Door de jaren heen is de behoefte aan reproduceerbare, efficiënte en lage-toxiciteit DNA-overdrachtsreagentia sterk toegenomen. Transfect™ DNA In Vitro 2000 V2 is ontworpen voor in vitro toepassingen die een hoge-efficiëntie DNA-inbrenging vereisen in een breed scala aan zoogdiercellen, inclusief moeilijk te transfekteren primaire cellen.

Door gebruik te maken van kationische lipide-chemie bereikt Transfect™ DNA In Vitro 2000 V2 superieure complexatie van plasmide-DNA, waardoor verbeterde internalisatie via endocytosepaden mogelijk wordt gemaakt (NIH Endocytosis Guide). De resulterende genexpressie is ideaal voor toepassingen die variëren van basale genexpressie-analyse tot geavanceerde moleculaire mechanisme-onderzoeken.

Overzicht van DNA-transfectie

Transfectie, verschillend van natuurlijke genoverdracht zoals bacteriële transformatie en virale transductie, gebruikt fysieke, chemische of lipide-gebaseerde methoden om DNA-inname door cellen mogelijk te maken.

Belangrijke barrières voor DNA-inbrenging zijn onder andere:

• Celmembranen (NIGMS Cell Structure Overview),

• Endosomale membranen (NCBI Vesicle Transport),

• Nucleaire envelop, vooral uitdagend in niet-delende cellen (NLM Nuclear Transport Processes).

Kationische lipiden, zoals gebruikt in Transfect™ DNA In Vitro 2000 V2, vormen elektrostatische complexen met DNA en beschermen het genetische materiaal tijdens intracellulaire transportprocessen (CDC Laboratory Cell Transport).

Samenstelling van Transfect™ DNA In Vitro 2000 V2

Transfect™ DNA In Vitro 2000 V2 bevat een eigen mengsel van:

• Kationische lipiden,

• Neutrale lipiden om membraanfusie te bevorderen,

• Gespecialiseerde stabilisatoren om de integriteit van het complex te behouden (FDA CMC Biologic Regulations).

Deze componenten werken synergetisch om maximale DNA-condensatie en celopname te bereiken zonder aanzienlijke membraanschade of toxiciteit (NCBI Cytotoxicity Comparisons).

Belangrijkste kenmerken en voordelen

• Brede toepasbaarheid voor celtypen: Inclusief HEK293, CHO, NIH-3T3, Jurkat, primaire neuronen en stamcellen (ATCC Cell Line Authentication).

• Hoge efficiëntie: >95% transficiëntie in makkelijk transfekteerbare cellijnen, 70–85% in moeilijkere primaire cellen (NIH Molecular Biology Research Reports).

• Minimale cytotoxiciteit: Behoud van hoge levensvatbaarheid na 72 uur (FDA Cell Viability Assessment Guide).

• Compatibel met serum: Geen noodzaak om media te veranderen (NIH Standard Culture Protocols).

• Schaalbaarheid: Van 96-well plaat assays tot literschaal culturen (PubMed Large Scale Culture).

Werkingsmechanisme van DNA-opname en -expressie

De lipide-DNA-complexen interageren met celmembranen via clathrine-gemedieerde endocytose en macropinocytose.

Na endocytische opname:

• Destabiliseren de complexen endosomale membranen,

• Ontsnapt DNA in het cytoplasma (NIH Endosomal Escape Mechanisms),

• Tijdens mitose verkrijgt DNA toegang tot de nucleaire compartimenten (NLM Mitosis and Nuclear Envelope Breakdown).

De hoogwaardige overdracht verzekert robuuste genexpressie zonder ongewenste cellulaire stressreacties (CDC Cell Stress Pathways).

Toepassingen

Plasmide DNA-expressie

Tijdelijke expressie van plasmiden die fluorescerende rapportereiwitten zoals GFP coderen, is gemakkelijk haalbaar, ideaal voor analyse via fluorescentiemicroscopie.

Overexpressie- en genregulatiestudies

Onderzoekers die promotoractiviteit of transcriptiefactorbinding onderzoeken, vertrouwen op efficiënte DNA-transfectie (NIH Gene Regulation Resources).

Genoomtechnologie

Niet-virale levering van genoomengineeringshulpmiddelen zoals CRISPR-Cas9 wordt vergemakkelijkt door lipide-gebaseerde systemen (NIH Genome Engineering Techniques).

RNAi-studies

Plasmiden die shRNA of miRNA coderen, kunnen efficiënt worden geïntroduceerd voor gerichte genonderdrukking (NIH RNA Interference Methods).

Stamcelonderzoek

Transfect™ DNA In Vitro 2000 V2 ondersteunt gevoelige systemen zoals hESC’s en iPSC’s en behoudt stamceleigenschappen (NIH Stem Cell Markers).

Stap-voor-stap Transfectieprotocol

Benodigdheden

• Cellen op 60–80% confluente dichtheid (NIH Cell Culture Best Practices).

• Hoogwaardige, endotoxine-vrije plasmide-DNA (FDA Endotoxin Testing Standards).

• Medium met of zonder serum.

• Transfect™ DNA In Vitro 2000 V2 reagent.

Protocol

1. DNA verdunnen: 1–2 µg per 6-well in 100 µL serumvrij medium.

2. Reagens verdunnen: 2–4 µL afzonderlijk in 100 µL serumvrij medium.

3. DNA en reagens combineren: Zacht mengen en 10–20 minuten incuberen bij kamertemperatuur (CDC Laboratory Room Conditions).

4. Complex aan cellen toevoegen: Druppelgewijs toevoegen aan de kweekplaat.

5. Incuberen: Cellen houden bij 37°C en 5% CO₂.

6. Analyseren: Genexpressie meten na 24–72 uur.

Prestatiegegevens per celtype

Bron: gestandaardiseerde assays uitgevoerd volgens NIH Cell Assay Guidelines.

Vergelijking met andere methoden

Conclusie

Transfect™ DNA In Vitro 2000 V2 is een uitstekende keuze voor onderzoekers die streven naar hoge DNA-inbreng, lage toxiciteit en brede toepasbaarheid bij celonderzoek. De robuuste prestaties in uiteenlopende experimenten maken het een essentieel hulpmiddel in moderne moleculaire laboratoria.

Door optimale transfectie-omstandigheden te combineren met compatibiliteit met meerdere celtypen, stelt Transfect™ DNA In Vitro 2000 V2 laboratoria in staat om de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van hun onderzoeksprojecten aanzienlijk te verhogen.